SDS - PAGE 電泳

• 凝膠制備特殊要求

• 凝膠濃度選擇：根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的分子量大小選擇合適的凝膠濃度。一般來說，分離小分子蛋白質(zhì)（<20 20="" 60="" -="">60 kDa）則使用 7% - 8% 的凝膠。

• 嚴(yán)格控制試劑比例：丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的比例、緩沖液的 pH 值以及引發(fā)劑和加速劑的用量等都要精確控制，以保證凝膠的聚合效果和孔徑大小均勻性。例如，通常使用的分離膠緩沖液 pH 為 8.8，濃縮膠緩沖液 pH 為 6.8，過硫酸銨和四甲基乙二胺（TEMED）的用量要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，一般過硫酸銨的濃度在 0.1% - 0.5%，TEMED 的濃度在 0.05% - 0.1%。

• 氣泡處理特殊要求：由于 SDS - PAGE 電泳對(duì)條帶的分辨率要求較高，凝膠中的氣泡會(huì)嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的遷移和分離效果，因此在氣泡處理上要更加嚴(yán)格。在凝膠灌注過程中，可采用長針頭注射器將凝膠溶液緩慢注入電泳槽中，盡量避免溶液與空氣接觸產(chǎn)生氣泡。如果發(fā)現(xiàn)凝膠中有氣泡，應(yīng)及時(shí)用細(xì)針挑破或采用振動(dòng)法使氣泡排出，確保凝膠中無氣泡存在，以獲得清晰、整齊的蛋白質(zhì)條帶。

瓊脂糖凝膠電泳

• 凝膠制備特殊要求

• 瓊脂糖純度和濃度：根據(jù)分離的核酸片段大小選擇合適的瓊脂糖濃度。一般來說，分離小于 0.5 kb 的 DNA 片段，可使用 2.0% - 3.0% 的瓊脂糖凝膠；分離 0.5 - 2 kb 的 DNA 片段，常用 1.0% - 1.5% 的凝膠；而對(duì)于大于 2 kb 的 DNA 片段，則使用 0.7% - 1.0% 的瓊脂糖凝膠。同時(shí)，要選擇高純度的瓊脂糖，以減少雜質(zhì)對(duì)核酸遷移的影響。

• 加熱溶解均勻：在制備瓊脂糖凝膠時(shí)，需要將瓊脂糖粉末加入到緩沖液中加熱溶解。加熱過程中要不斷攪拌，確保瓊脂糖溶解，避免出現(xiàn)局部濃度過高或過低的情況。溶解后的瓊脂糖溶液要冷卻至適當(dāng)溫度（一般為 50 - 60℃）后再倒入模具中，防止溫度過高導(dǎo)致凝膠收縮或產(chǎn)生氣泡。

• 氣泡處理特殊要求：瓊脂糖凝膠電泳中氣泡的存在可能會(huì)導(dǎo)致核酸條帶變形或出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象。在倒入瓊脂糖溶液時(shí)，動(dòng)作要平穩(wěn)，避免產(chǎn)生氣泡。如果有氣泡產(chǎn)生，可以用吸管將其吸出，或者待凝膠凝固后，用刀片將含有氣泡的部分切除。對(duì)于一些低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，由于其凝固點(diǎn)較低，在處理氣泡時(shí)要注意保持環(huán)境溫度穩(wěn)定，避免凝膠在處理過程中融化。

等電聚焦電泳

• 凝膠制備特殊要求

• 兩性電解質(zhì)選擇：等電聚焦電泳需要使用兩性電解質(zhì)來形成 pH 梯度。不同的樣品需要選擇合適的兩性電解質(zhì)混合物，其 pH 范圍要涵蓋目標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。例如，對(duì)于等電點(diǎn)在 4 - 6 之間的蛋白質(zhì)，可選擇 pH 3 - 10 的兩性電解質(zhì)，并適當(dāng)調(diào)整其比例，以獲得更精確的 pH 梯度。

• 凝膠聚合條件精確控制：凝膠的聚合過程要嚴(yán)格控制溫度、時(shí)間和引發(fā)劑的用量，以確保凝膠中 pH 梯度的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。一般在低溫（4 - 10℃）下進(jìn)行聚合，聚合時(shí)間相對(duì)較長，可能需要數(shù)小時(shí)甚至過夜。引發(fā)劑的用量要根據(jù)具體的凝膠配方和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，以保證凝膠聚合均勻，pH 梯度穩(wěn)定。

• 氣泡處理特殊要求：等電聚焦電泳中氣泡的存在會(huì)干擾 pH 梯度的形成，影響蛋白質(zhì)的聚焦效果。在凝膠制備過程中，要盡量避免氣泡的產(chǎn)生。如果出現(xiàn)氣泡，應(yīng)采用溫和的方法去除，如使用細(xì)針小心地將氣泡挑出，或者在凝膠表面覆蓋一層液體石蠟，防止空氣進(jìn)入凝膠產(chǎn)生氣泡。同時(shí)，在電泳過程中，也要注意觀察凝膠中是否有新的氣泡產(chǎn)生，如有需要及時(shí)處理。